在蛋白互作研究中，免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）作为一种经典而可靠的实验方法，被广泛用于验证和捕捉体内存在的蛋白-蛋白相互作用。然而，尽管原理相对简单，实际操作中却容易出现许多技术性问题，抗体重链污染或轻链污染Western blot（WB）检测结果便是其中最令人头疼的困扰之一。当我们使用IgG类抗体进行Co-IP，并在WB检测中同样使用抗IgG类二抗时，常会在25 kDa（轻链）和50 kDa（重链）位置看到强烈的背景条带。这种抗体污染不仅干扰目标蛋白的判断，还可能导致错误的数据解释，严重影响实验结果的可信度。那么，这个问题该如何有效解决？

一、抗体重链污染的本质来源

Co-IP实验通常使用Protein A/G磁珠或琼脂糖珠富集抗体复合物，通过变性洗脱后进行SDS-PAGE和WB检测。然而，在此过程中，捕获靶蛋白的抗体本身也会被洗脱下来。由于SDS变性处理会使抗体分离为重链（约50 kDa）和轻链（约25 kDa），这些抗体成分在WB中会被二抗识别，从而在膜上留下明显的条带。这种干扰尤以目标蛋白分子量接近50或25 kDa时最为显著，常常导致蛋白条带模糊不清或无法区分真假阳性。

二、如何有效解决Co-IP抗体重链污染问题？

以下是目前主流的几种解决方案，每种方法适用于不同的实验场景和研究目标：

1、抗体交联到磁珠或琼脂糖珠

这是目前最常见且有效的解决策略之一。通过化学交联剂（如DSS、BS3等）将抗体共价固定到Protein A/G磁珠上，即可在洗脱步骤中避免抗体自身被释放，从而有效杜绝抗体重链污染和轻链污染。

（1）优点：

• 可显著降低背景干扰
• 洗脱产物更干净，适合后续质谱检测
• 抗体珠可重复使用，提高实验性价比

（2）注意事项：

• 交联过程需优化pH和浓度条件，避免影响抗体活性
• 部分抗体可能在交联后丧失亲和力

2、使用TrueBlot或Clean-Blot类专用二抗

针对IgG重链污染问题，一些公司开发了特殊二抗（如Rockland的TrueBlot®、BioLegend的Clean-Blot™），这类二抗能选择性识别本底中非变性的IgG，而不识别经过SDS变性的抗体重链。

（1）优点：

• 操作简便，无需更改IP流程
• 适用于已完成Co-IP但检测干扰严重的情况
• 可与抗体和磁珠兼容使用

（2）适用范围：

• 适合进行Western blot检测
• 对质谱样本意义不大

若您已完成样本Co-IP，但发现Western条带污染严重，不妨考虑更换此类特异性更高的二抗。

3、采用标签抗体或标签系统进行IP

若实验设计允许，可以考虑使用带有标签（如FLAG、HA、Myc、His等）的融合蛋白，并用抗标签抗体进行免疫沉淀。此类抗体往往纯度高、特异性强，结合竞争洗脱（如FLAG肽洗脱）还可以避免抗体重链污染问题。

优势：

• 抗体本身可不参与洗脱
• 适合构建稳定表达细胞株进行体系化研究
• 可与标签特异性WB二抗配合，提升信号特异性

4、优化Western blot检测策略

在Co-IP实验已经完成，样品已制备的前提下，若无法重新设计免疫沉淀流程，也可通过改变WB策略来规避抗体重链污染：

• 使用轻链特异性二抗，只识别目标抗体轻链，避免重链背景
• 若目标蛋白有标签，可使用抗标签抗体进行WB检测，完全避开IgG识别区域
• 采用更高分辨率的PAGE胶（如Tris-Tricine系统）进行区分

这些策略虽不能从源头杜绝污染，但可在结果分析阶段尽可能减少干扰，提高检测的清晰度与准确性。

Co-IP实验中抗体重链污染是一个老生常谈却依然高发的问题。幸运的是，通过抗体交联、TrueBlot二抗、标签策略或优化WB检测流程等多种手段，完全可以有效应对这一挑战。选择最合适的策略，应基于实验目的、目标蛋白分子量、抗体特性以及后续应用（如是否上质谱）等因素综合考虑。作为专业的蛋白互作研究服务平台，百泰派克生物科技不仅提供标准化Co-IP实验流程，更通过定制化服务，帮助科研人员高效推进课题进展，提升结果的可信度和可发表性。如您在Co-IP或蛋白互作研究中遇到任何困扰，欢迎随时咨询我们的技术团队。我们致力于以专业、高效、可追溯的科研服务，助力每一位科研学者的探索之路走得更远。

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百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

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北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

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