研究团队收集了40例sALS患者的血液样本，发现50%的患者存在mtDNA突变（如COXI基因6692A缺失），导致CIV关键亚基翻译提前终止。此外，对29例sALS患者的肌肉活检发现，部分患者肌肉中存在COX缺陷纤维，且运动神经元（MN）中CIV亚基表达显著降低。通过将329名ALS患者运动神经元的RNA测序（RNA-seq）数据与他们的生存时间进行比较发现，CIV低表达的ALS患者生存期更短。

利用线粒体基因组编辑技术（DdCBE），研究团队在大鼠神经元中特异性敲除CIV亚基（COXII/III），成功构建了首个模拟sALS的动物模型。这些大鼠逐渐出现体重减轻、骨骼肌萎缩、后凸和瘫痪等ALS样表型。

研究人员对出生后3周、1个月和2个月的COXIIINeuN-Cre大鼠与COXIIILSL对照组之间进行了多项运动行为测试，这些大鼠出现渐进性运动缺陷的发展类似于人类ALS症状的进展。因此，CIV的神经元缺陷导致大鼠出现多种类似ALS的表型。

3. CIV缺陷大鼠的选择性MN丢失

鉴于严重的后肢运动缺陷是经典ALS表型特征，研究团队对CIV缺陷大鼠腰椎脊髓α运动神经元特异性减少，而γ运动神经元未受影响。同时，通过免疫荧光染色可以观察到运动神经元（αMNs）的显著减少，而其他类型的神经元则相对正常。这些数据表明，在这些神经元CIV受损的大鼠中，即使在不同亚型的运动神经元之间也存在选择性易损性。

4. 去神经支配和骨骼肌萎缩

ALS的另一个标志是肌肉萎缩，研究者评估了模型大鼠的胫前肌和腓肠肌。在疾病晚期，模型大鼠的胫前肌和腓肠肌的重量明显低于其野生型（WT）对照。通过Wheat Germ Agglutinin（WGA）染色可以观察到肌肉纤维的萎缩，肌纤维的平均截面积显著减小。

此外，神经肌肉接头（NMJ）的完整性受损，表现为神经末梢与肌纤维的连接减少。研究者进一步对胫前肌的神经肌肉接点（NMJ）进行了深入分析，该肌肉主要由腰椎脊髓中的α运动神经元支配的快缩肌纤维组成，这在人体中对肌萎缩侧索硬化症（ALS）特别敏感。在对CIV损伤的反应中，NMJ的衰弱表现得非常明显，NF和突触素2信号都明显减少。对腓肠肌的电生理记录显示，由坐骨神经引起的复合肌肉动作电位（CMAP）振幅明显下降。这些数据表明在CIV缺陷模型中NMJ的完整性受到损害，这种情况通常出现在ALS患者中。

5. 神经炎症升高和细胞死亡

为了阐明观察到的CIV缺陷大鼠中MN损失的机制，研究者对COXIII-LSL与COXIII-NeuN-Cre大鼠的腰脊髓前角进行了单细胞核RNA测序(snRNA-seq)和基因集富集分析（GSEA）。snRNA-seq揭示，小胶质细胞介导的神经炎症和GSDME依赖性细胞坏死是MN丢失的关键驱动因素。差异表达基因（DEGs）主要与四个通路相关，包括神经炎症反应、钙离子跨膜运输、神经元凋亡过程和与其他神经细胞比较下的α运动神经元突触可塑性。值得注意的是，被鉴定为脊髓损伤的神经元特异性生物标志物的ATF3在α运动神经元中也被显著激活，涉及髓鞘抑制和反射迟钝的基因也均被激活。神经元CIV缺乏导致约70%的运动神经元在出生后第6周出现TDP-43细胞质错误定位，伴随有ATP生产减少。此外，诱导细胞坏死的GSDME基因（编码Gasdermin E蛋白）也被激活。这些数据表明，大鼠模型重现了ALS患者的许多关键特征。